高糖通过抑制蛋白磷酸酶2A下调自噬导致HL-1细胞损伤的机制
李勇 ;丁菁 ;梁政伟 ;张俊诗 ;张荣瑞 ;吕莎 ;邓亚竹 ;张倩 ;陆德琴 ;目的 通过观察高糖(HG)条件下蛋白磷酸酶2A(PP2A)催化亚基Cα/β、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)以及螯合体1(SQSTM1/p62)蛋白在小鼠心肌细胞株(HL-1)中的表达变化，探讨PP2ACα蛋白表达减少或PP2A酶活性降低是否通过抑制自噬水平而导致HG心肌细胞的损伤。方法 采用不同浓度HG(11、22、33和44 mmol/L)处理72 h, 33 mmol/L HG处理不同时间(24、48及72 h)体外培养HL-1细胞，并设正常葡萄糖组(NG组，5.5mmol/L葡萄糖)和甘露醇组(Mannitol组，终浓度为33或44 mmol/L)作为对照；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测心肌细胞活力，明确HG对心肌的损伤作用以及HG处理浓度和时间；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测p-PP2ACα Tyr307和PP2ACα/β蛋白水平，以及HG、氯喹(CQ)和雷帕霉素(RAPA)处理后的LC3B和SQSTM1/p62蛋白表达，以明确细胞自噬情况；实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测Map1lc3b和sqstm1的mRNA表达水平；使用冈田酸盐(OA,10 nmol/L)抑制PP2A活性，以及在稳定敲低或过表达Ppp2cα后，检测HL-1心肌细胞活力、细胞培养基上清液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、细胞LC3B和SQSTM1/p62的蛋白及mRNA水平。结果 HG处理以时间和浓度依赖方式降低HL-1心肌细胞活力，增加细胞中p-PP2ACα Tyr307水平，并减少PP2ACα/β蛋白表达(P<0.05);HG处理还可降低LC3B和SQSTM1/p62蛋白和mRNA表达(P<0.05);在NG和HG条件下，CQ处理可增加SQSTM1/p62蛋白水平，RAPA可增加LC3B蛋白表达，并减少SQSTM1/p62蛋白表达(P<0.05);OA可降低心肌细胞活力，并加重心肌细胞损伤(P<0.05),减少LC3B和SQSTM1/p62蛋白及mRNA表达水平(P<0.05);敲低Ppp2cα结果与OA处理效应相似，过表达Ppp2cα可部分恢复心肌细胞活力，并减轻心肌细胞损伤，增加LC3B和SQSTM1/p62蛋白及mRNA水平(P<0.05)。结论 PP2A酶活性降低或PP2ACα蛋白表达减少促进了HG导致的心肌损伤，其分子机制与抑制Map1lc3b和sqstm1的mRNA转录有关。
头花蓼在幽门螺杆菌感染慢性胃炎小鼠TGF-β信号通路与Th17/Treg平衡中的作用
朱程杰 ;孙朝琴 ;何芸 ;莫非 ;目的 观察头花蓼对幽门螺杆菌(H.pylori)感染慢性胃炎小鼠转化生长因子β(TGF-β)信号通路相关蛋白，及辅助性T细胞17(h17)/调节性T细胞(Treg)平衡、炎症因子表达的影响。方法 将C57BL/6小鼠分为空白组(n=23,Control组)和H.pylori感染组(n=43,H.pylori组),H.pylori组小鼠给予H.pylori菌液灌胃构建慢性胃炎模型，空白组小鼠灌胃等量无菌肉汤；将建模成功的小鼠随机平均分成模型组和给药组，给药组小鼠给予头花蓼水提浸膏粉灌胃，空白组和模型组给予等量无菌生理盐水灌胃；采用苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜病理形态学变化，流式细胞术检测脾脏Th17、Treg细胞水平，实时定量反转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)法和蛋白免疫印迹实验(Western blot)法检测胃黏膜TGF-β通路相关基因TGF-β1、转化生长因子β激活激酶1(TAK1)及Th17、Treg细胞转录因子维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)、叉头转录因子(Foxp3)的蛋白和mRNA表达水平，免疫荧光染色测定胃黏膜Th17、Treg细胞白细胞介素-17(IL-17)、Foxp3蛋白的表达，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血炎症因子水平。结果 造模成功的H.pylori感染慢性胃炎小鼠胃黏膜有大量炎症细胞浸润，胃黏膜变薄，头花蓼治疗后的小鼠胃黏膜变薄程度减轻，炎症细胞浸润变少，同时发现慢性胃炎小鼠体内TGF-β信号通路分子表达增高，Th17/Treg细胞比例下降，头花蓼治疗后降低了TGF-β信号通路分子表达，使Th17/Treg细胞比例下降，提示头花蓼可能通过调节免疫平衡，从而减轻H.pylori感染慢性胃炎小鼠的炎症反应。结论 头花蓼可能通过抑制TGF-β信号通路的激活，下调Treg细胞表达，从而调节H.pylori感染导致的Th17/Treg细胞失衡，在改善H.pylori诱导的慢性胃炎小鼠胃黏膜炎症反应中发挥作用。
幽门螺杆菌感染促进EAT小鼠甲状腺损伤与凋亡的实验研究
王才虹;华宇羽;覃丹;蔡燕;杨莹;申婷婷;文静;目的 分析幽门螺杆菌(Hp)感染对自身免疫性甲状腺炎(AIT)小鼠甲状腺损伤与凋亡的影响。方法 51只雌性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组(Control组)、实验性AIT组(EAT组)、Hp感染组(EAT+Hp组),每组17只；除Control组，其余两组小鼠均建立EAT模型；EAT造模成功后，EAT+Hp组小鼠在两周内接受了7次1×109 CFU/mL的Hp菌液灌胃，Control组和EAT组则同步给予等体积生理盐水；末次Hp干预后12周，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清抗过氧化物酶抗体(TPOAb)、抗甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺素(TSH),以及炎症因子白介素-17A(IL-17A)、白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β1(TGF-β1)水平；苏木素-伊红(HE)染色评估甲状腺组织病理形态并进行炎症评分；原位末端标记法(TUNEL)检测小鼠甲状腺细胞凋亡情况；实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测甲状腺Fas与Caspase-3的mRNA表达水平；蛋白免疫印迹法(Western blot)和免疫组织化学(IHC)染色检测甲状腺Fas与裂解Caspase-3蛋白表达情况。结果 EAT模型小鼠呈现出甲状腺功能减退特征，血清FT3、FT4水平较Control组显著降低(P<0.05),同时伴有TSH代偿性升高(P<0.01),在此基础上，合并Hp感染进一步加剧了甲状腺功能损伤，FT4进一步下降(P<0.05),TSH水平也相应升高(P<0.05);在自身免疫应答方面，EAT组小鼠TPOAb水平较Control组显著上升(P<0.001),Hp感染促进了自身抗体的进一步生成，TPOAb与TGAb均较EAT组升高(P<0.05);炎症因子检测显示，EAT组促炎因子IL-17A明显高于Control组(P<0.01),而抗炎因子IL-10与TGF-β1则显著降低(P<0.05),Hp感染加剧了这种免疫失衡，使IL-17A进一步上升，IL-10与TGF-β1下降更为明显；组织病理学检查可见EAT组甲状腺结构破坏伴淋巴细胞浸润，Hp感染后损伤程度加重，炎症评分显著升高(P<0.05);在凋亡机制层面，荧光显微镜下见EAT+Hp组较EAT组凋亡阳性细胞表达增多，EAT组甲状腺组织中Fas与Caspase-3 mRNA表达均显著上调(P<0.001),Hp感染后Fas表达进一步升高(P<0.001);Western blot与免疫组织化学结果表明Hp感染促进Fas与裂解Caspase-3蛋白的表达，增强甲状腺细胞凋亡。结论 Hp感染可能破坏Th17/Treg平衡，加剧甲状腺细胞凋亡，从而进一步加重小鼠的AIT。
七氟烷介导m6A修饰调控NMDA受体表达对小鼠围术期神经认知功能障碍的影响
刘婷;曹莹;甘秘;洪森;何婷婷;曾庆繁;目的 探讨七氟烷介导N6-甲基腺苷(m6A)修饰对围术期神经认知功能障碍(PND)小鼠N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)表达的影响。方法 96只雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组(C组，不做处理)、麻醉对照组(A组，吸入七氟烷)、假手术对照组(Sh组，吸入七氟烷+正中开腹)及手术组(S组，吸入七氟烷+肠系膜上动脉短暂夹闭),Sh组与S组使用局部麻醉药进行围术期镇痛；根据术后处死时间(第7、14、21天),随机将各组再分为三亚组(n=8),采用旷场(OF)、物体识别记忆(ORM)、物体位置记忆(OLM)实验测定小鼠认知功能；苏木素-伊红(HE)染色观察小鼠海马组织学变化；比色法测定m6A的表达丰度；蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测NMDAR的2B亚基(NR2B)、m6A去甲基化酶AlkB同源蛋白5(ALKBH5)表达水平。结果 与C7组相比，Sh7和S7组新物体及位置转换物体探索时间辨别比(DR)降低(P<0.05),海马神经元出现严重损伤，海马m6A表达丰度及NR2B表达降低(P<0.05),ALKBH5蛋白表达增加(P<0.05);A7组DR值无差异，海马神经元损伤程度较轻，m6A表达丰度、NR2B及ALKBH5表达均无差异(P>0.05);与C14组相比，A14、Sh14、S14组DR值无差异(P>0.05),海马m6A表达丰度无差异(P>0.05),神经元损伤改善；S14组ALKBH5表达增加(P<0.05),NR2B表达降低(P<0.05);与C21组相比，A21、Sh21、S21组小鼠未出现物体识别记忆及位置记忆障碍，m6A表达丰度、NR2B及ALKBH5表达均无差异(P>0.05)。结论 ALKBH5介导的m6A去甲基化可能降低NR2B的表达，七氟烷可能影响m6A修饰调控NMDAR表达而参与PND的发生。
重组鞭毛素蛋白诱导小鼠三阴性乳腺癌细胞铁死亡的研究
谭聪研;袁军;目的 探讨重组鞭毛素蛋白(rFliC)对小鼠三阴性乳腺癌(TNBC)4T1细胞铁死亡效应的影响。方法 将4T1细胞分为空白对照组(Control)、rFliC组以及添加铁死亡抑制剂(Fer-1)的rFliC+Fer-1组，采用CCK-8细胞增殖试验及克隆形成实验检测4T1细胞的增殖和存活能力；采用试剂盒检测4T1细胞丙二醛(MDA)、还原型谷胱甘肽(GSH)及亚铁离子(Fe2+)水平，通过透射电子显微镜观察4T1细胞线粒体形态学变化，采用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)、C11-BODIPY 581/591荧光探针分别分析线粒体膜电位(MMP)、脂质活性氧(ROS)水平，采用蛋白免疫印迹法(Western blot)技术检测4T1细胞铁死亡相关蛋白胱氨酸-谷氨酸反向转运体亚基(XCT)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)及转铁蛋白受体1(TfR1)的表达水平。结果 经rFliC处理的4T1细胞存活率和克隆形成效率受到明显抑制，且与铁死亡相关(P<0.05);rFliC组中MDA、Fe2+水平升高、GSH水平下降(P<0.05);透射电镜分析显示，rFliC组表现出线粒体体积减小、膜密度增加、嵴结构减少或消失等铁死亡现象；JC-1和C11-BODIPY 581/591荧光探针的分析结果表明，rFliC组4T1细胞MMP水平下降、ROS水平升高；rFliC能降低XCT、TfR1蛋白表达水平，提升ACSL4蛋白表达水平(P<0.05)。结论 rFliC能诱导小鼠TNBC 4T1细胞铁死亡。
