倪佳,王伟,徐莹莹,陈相屹,张欣,孙达权

摘要(Abstract)：

目的 采用原核表达和亲和层析的方法获得人细胞角蛋白18(CK18)。方法 利用高保真聚合酶链式反应(PCR)法克隆人CK18基因的蛋白编码区,TA克隆入pMD18?T载体中;经筛选和鉴定后,将CK18基因编码区插入原核表达载体pGEX?4t?1中,构建重组质粒pGEX?CK18GST;将重组质粒导入感受态细菌Rosetta(DE3)中,用异丙基?β?D?硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CK18融合蛋白(GST?CK18)表达,并用GST亲和层析分离纯化CK18蛋白;用体外磷酸化、免疫组化等方法验证CK18磷酸化位点及其对细胞的影响。结果 成功克隆人CK18基因蛋白编码区,构建了原核表达质粒pGEX?CK18GST,表达了GST?CK18并获得纯化蛋白,体外磷酸化、免组织化学方法均证实CK18的52位丝氨酸磷酸化可以导致细胞骨架重排和细胞形态变化。结论 成功获得纯化的人CK18蛋白,为体外研究CK18和蛋白激酶之间的关系奠定了前期基础。

关键词(KeyWords)： 细胞角蛋白18(CK18);聚合酶链式反应;基因克隆;原核表达;蛋白纯化;肝癌

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作者(Author): 倪佳,王伟,徐莹莹,陈相屹,张欣,孙达权

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