贵州医科大学学报

2017, (02)

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大鼠shRNASlfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定

刘姿麟1,林慕之1,况春燕1,2,刘兴德3

摘要(Abstract):

目的:构建大鼠睡眠因子 1(Slfn1)基因的发夹状 RNA质粒,并进行腺病毒载体包装。方法:根据Ratslfn1基因的转录本设计并合成 3个干扰 RNA靶点 ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及 ShRNA-Slfn1(3),并将单链的引物退火成双链 oligo序列,连接入双酶切线性化的 RNA干扰载体(pDKD-CMV-U6-shRNA)的 U6启动子下游,替换掉原来的 ccdB基因;利用 Admax系统,将 3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定;利用 Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签,通过 WesternBlot检测 Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染 293T细胞中 Flag表达,观察靶点质粒对 Slfn1表达的影响。结果:经菌落 PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确,表明构建质粒成功;腺病毒包装ShRNA-Slfn1(1)、ShRNA-Slfn1(2)及 ShRNA-Slfn1(3)的病毒滴度分别为 1.0×1014ifu/L,2.5×1014ifu/L,6.3×1013ifu/L,WesternBlot证实 ShRNA-Slfn1(1)及 ShRNA-Slfn1(3)能显著降低转染 293T细胞中 Flag的表达,确定shRNA-Slfn1(1)及 shRNA-Slfn1(3)为目的质粒。结论:成功构建了大鼠 shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。

关键词(KeyWords): 睡眠因子 1;RNA干扰;腺病毒载体;短发夹 RNA;构建;大鼠

Abstract:

Keywords:

基金项目(Foundation): 国家自然科学基金(81360034,81560056)

作者(Author): 刘姿麟1,林慕之1,况春燕1,2,刘兴德3

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